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Custodisce alcune tra le più importanti collezioni di pittura e scultura al mondo: fra queste si annovera la statuaria michelangiolesca, con il celeberrimo David e i Prigioni; la ricca raccolta di pittura italiana con le tavole a fondo oro (l’Annunciazione di Lorenzo Monaco e il Compianto sul Cristo morto di Giovanni da Milano fra le altre) o dipinti celebri del Rinascimento come la Deposizione del Bronzino e la Venere e Cupido del Pontomo. Non meno rilevante è la collezione di modelli e calchi in gesso di Lorenzo Bartolini e Luigi Pampaloni che compongono la Gipsoteca. Il museo ospita anche preziosi strumenti musicali appartenuti ai granduchi Medici e Lorena, provenienti in gran parte dalle collezioni del Conservatorio Luigi Cherubini di Firenze.